Para ilmuwan menentukan 5.072 gen manusia yang esensial

Read Also

Dalam sebuah studi baru-baru ini yang diterbitkan dalam jurnal Cell, para peneliti memeriksa phenotypic landscape dari beberapa gen manusia esensial yang sulit dipahami untuk menciptakan sumber daya genotipe-fenotipe terperinci yang menguraikan konsekuensi fenotipik dari mengganggu proses seluler mendasar.

Latar belakang

Menentukan peran gen esensial dalam proses seluler yang berbeda, termasuk memvisualisasikan kontribusinya terhadap morfologi sel, sangat penting untuk memahami dasar pertumbuhan, proliferasi, dan fungsionalitas sel.

Tentang studi

Dalam penelitian ini, para peneliti pertama kali melakukan Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) - skrining fungsional berbasis protein 9 (Cas9) terkait CRISPR dan mengidentifikasi 5.072 gen esensial yang memberikan kebugaran. Selanjutnya, mereka memilih empat sekuens single guide ribonucleic acid (sgRNA) yang menargetkan setiap gen dan 250 sgRNA ‘‘non-targeting’”, dari sgRNA libraries yang ada.

Mereka mengirimkan pustaka sgRNA ke sel HeLa yang berisi konstruk Cas9 terintegrasi yang dapat diinduksi doksisiklin. Selanjutnya, mereka memperbaiki sel dan memperkuat urutan sgRNA in situ. Kemudian, mereka mewarnai dan mencitrakan sel menggunakan empat noda yang membantu mereka visualize nuclear morphology, deoxyribonucleic acid (DNA) damage response, microtubules, dan filamentous actin.

Setelah mengklasifikasikan sel sebagai interfase atau mitosis, tim melakukan analisis hilir. Skrining berbasis pencitraan ini menghasilkan gambar mikroskopis, yang membantu para peneliti mengekstrak pengukuran fenotipik untuk 1.084 parameter gambar sel, termasuk pengukuran intensitas, distribusi subseluler, kolokalisasi noda, serta ukuran dan bentuk seluler dan inti. Para peneliti mencocokkan identitas sgRNA untuk lebih dari 31 juta sel dengan median 6.119 sel per target gen untuk empat sgRNA. Akhirnya, para peneliti mengumpulkan pencitraan sel hidup untuk mengidentifikasi gen yang diperlukan untuk segregasi kromosom.

Temuan studi

Analisis berbasis mikroskop gabungan dari> 31 juta sel knockout individu untuk ribuan gen manusia yang memberikan kebugaran mengidentifikasi kontribusi spesifik untuk proses biologis inti berdasarkan fenotipe seluler yang dihasilkan. Parameter sel secara langsung dapat dibandingkan di seluruh populasi sel besar, yang disebut sebagai ‘‘fingerprints’’ fenotipik dari target gen. Dengan membandingkan profil fenotipe ini, para peneliti mendefinisikan hubungan gen ko-fungsional dengan resolusi yang cukup untuk membedakan peran terkait dalam proses seluler tertentu. Namun, hanya empat pewarnaan seluler yang cukup untuk mengidentifikasi hubungan fungsional antara gen di berbagai jalur biologis tanpa menganalisis biomarker seluler spesifik yang sesuai dengan setiap jalur seluler yang memiliki fungsi berbeda.

Selain mengidentifikasi hubungan yang mapan, pekerjaan saat ini memberikan banyak prediksi untuk kontribusi gen yang dicirikan tidak lengkap untuk proses seluler mendasar. Misalnya, analisis pengelompokan fenotipe melibatkan C7orf26 sebagai subunit kompleks integrator inti, C1orf131 sebagai pengatur biogenesis ribosom, dan AKIRIN2 dalam fungsi proteasome. Mereka juga mengidentifikasi KO gen yang mengakibatkan cacat pada fungsi mitosis, termasuk peran tak terduga untuk transporter terikat membran AQP7 dan ATP1A1 dan osmolaritas seluler dalam mempromosikan pemisahan kromosom yang akurat.

Selain itu, makalah ini mengungkapkan peran beberapa regulator ekspresi gen dalam mengendalikan pembelahan sel, termasuk faktor transkripsi yang diprediksi ZNF335, kompleks DREAM (LIN52), kompleks pemrosesan mRNA 30-end (CLP1), dan spliceosome minor (RNPC3) di ekspresi komponen pembelahan sel tertentu. Contoh-contoh ini menyoroti kekuatan penyaringan optik untuk mengidentifikasi gen ko-fungsional di berbagai jalur biologis, dengan potensi penemuan lebih lanjut dari data yang diterbitkan di sini.

Kesimpulan

Para peneliti secara efisien memanfaatkan fenotipe berbasis gambar multidimensi yang kompleks untuk menghasilkan kluster gen yang relevan secara fungsional di seluruh proses seluler yang beragam pada skala yang jauh lebih besar daripada layar profil gabungan berbasis gambar mana pun. Akibatnya, para peneliti sekarang memiliki sumber data yang kuat untuk dijelajahi dan testbed yang komprehensif untuk mengembangkan teknik analisis.

Dua protein mungkin bertindak dalam satu jalur biologis tanpa menunjukkan interaksi langsung. Selain secara tepat mengidentifikasi gen ko-fungsional di berbagai proses seluler, penelitian saat ini memberikan pendekatan ortogonal yang sangat skalabel untuk studi interaksi protein proteome-lebar. Lebih lanjut, profil fenotipik berbasis gambar kuantitatif sangat menentukan kluster gen untuk gen pan-esensial, seperti komponen ribosom, yang tidak menunjukkan berbagai persyaratan di seluruh lini sel. Dalam banyak kasus, analisis ini juga mengidentifikasi gen tambahan dan resolusi yang lebih halus untuk kluster gennya, yang memungkinkan pembedaan antara subunit ribosom inti dan faktor biogenesis ribosom.

Pendekatan studi juga sangat berhasil dalam mengidentifikasi kelompok gen untuk proses morfologis, termasuk sitokinesis, transpor nuklir, kondensasi kromosom, dan lainnya, yang mungkin sulit diidentifikasi berdasarkan perubahan transkripsi. Ini juga menghasilkan data profil yang kompleks, dan identitas gangguan untuk setiap sel memungkinkan menghubungkan beberapa fenotipe dimensi tinggi secara langsung dengan gangguan individu dalam satu percobaan. Secara keseluruhan, layar profil CRISPR gabungan berbasis gambar yang relatif murah muncul sebagai strategi yang kuat untuk mendefinisikan jaringan gen dan peran fungsional gen manusia. Selain itu, layar berbasis gambar yang dikumpulkan relatif sederhana untuk diskalakan dibandingkan dengan layar berbasis gambar yang disusun, dengan kontrol campuran yang memberikan dasar statistik yang kuat untuk perbandingan.

Journal reference:

The phenotypic landscape of essential human genes, Luke Funk, Kuan-Chung Su, Jimmy Ly, David Feldman, Avtar Singh, Brittania Moodie, Paul C.Blainey, Iain M.Cheeseman, Cell 2022, DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.10.017, https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0092867422013599