Chitin-immobilized nanobody untuk deteksi SARS-CoV-2
Dalam studi baru-baru ini yang diposting ke bioRxiv*, para peneliti mendemonstrasikan strategi baru untuk mendeteksi severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) menggunakan nanobodi yang diimobilisasi kitin.
Latar belakang
Shark dan Camelidae-derived nanobodies adalah alternatif
yang muncul untuk antibodi tradisional. Nanobodi berikatan dengan ligan pada
rentang nanomolar dan tetap stabil di bawah kondisi tekanan yang diinduksi oleh
panas/bahan kimia, menjadikannya kandidat yang menjanjikan untuk pengujian
antigen secara luas. Banyak nanobodi anti-SARS-CoV-2 telah direkayasa melalui
tampilan fag atau dengan imunisasi llama, hiu, dan alpaka.
Bentuk mikroba Ustilago maydis (jamur api jagung) dapat
dimanfaatkan untuk mensintesis protein heterolog seperti nanobodi. Baru-baru
ini, penulis membuat bukti prinsip untuk sintesis nanobodi anti-SARS-CoV-2.
Selain itu, mekanisme sekresi yang tidak konvensional yang digunakan oleh U.
maydis untuk mengekspor kitinase Cts1 dapat dimanfaatkan untuk sekresi protein
target heterolog. Cts1 memiliki aktivitas pengikatan kitin dan dengan demikian
dapat dieksploitasi sebagai tag imobilisasi dan pemurnian intrinsik. Jps1,
faktor penahan yang diperlukan untuk sekresi Cts1, dapat menjadi pembawa
alternatif.
Studi dan temuan
Dalam penelitian ini, para peneliti membuat pendekatan baru
untuk mendeteksi SARS-CoV-2 menggunakan nanobodi yang diimobilisasi kitin.
Pertama, mereka menyaring protein fusi nanobody-Cts1 yang berbeda untuk
ekspresi, sekresi yang tidak konvensional, dan aktivitas pengikatan terhadap SARS-CoV-2
spike’s receptor-binding domain (RBD). Empat konstruksi fusi nanobody-Cts1 disintesis
menggunakan dua llama-derived nanobodies (VHHE and VHHV) dan two synthetic
nanobodies (Sy15 and Sy68).
Selain itu, nanobody bivalen dihasilkan dengan memasangkan
VHHV dengan VHHE untuk menghasilkan nanobody VHHVE. Selain itu, nanobody VHHEE
bivalen diproduksi untuk menguji kemampuan pengikatan dimer. Versi nanobody
yang diterbitkan Sy68/15-Jps1 dan Sy68/15-Cts1 adalah kontrol. Ekspresi /
sekresi protein fusi target diperiksa melalui western blots.
Supernatan kultur menunjukkan sekresi protein fusi Sy15-Cts1,
VHHV-Cts1, VHHE-Cts1, Sy68 / 15-Jps1, dan VHHEE-Cts1 yang cukup. Aktivitas
pengikatan RBD dinilai menggunakan direct enzyme-linked immunosorbent assay
(ELISA) dari ekstrak sel yang mengandung protein fusi nanobody-Cts1. VHHEE-Cts1
dan Sy68/15-Jps1 menunjukkan pengikatan terkuat ke RBD, sedangkan VHHE-Cts1
menunjukkan sekitar setengah intensitas sinyal. Protein fusi yang tersisa tidak
memiliki aktivitas pengikatan yang jelas.
Selanjutnya, ketiga protein fusi ini dimurnikan dan
dievaluasi dalam ELISA langsung terhadap protein S1 SARS-CoV-2 full-length.
Ketiga protein fusi menunjukkan aktivitas pengikatan yang signifikan;
VHHEE-Cts1 dan Sy68/15-Jps1 memiliki peningkatan pengikatan dua kali lipat
dibandingkan dengan VHHE-Cts1. Para peneliti melakukan uji netralisasi yang
disesuaikan untuk menentukan apakah aktivitas in vitro diterjemahkan menjadi
pengikatan atau netralisasi in vivo.
VHHE-Cts1 tidak memiliki aktivitas penetralan, sementara
VHHEE-Cts1 dan Sy68/15-Jps1 menunjukkan aktivitas penetralan virus. Karena Cts1
dapat mengikat permukaan yang dilapisi kitin seperti manik-manik magnetik
kitin, karakteristik ini dapat dimanfaatkan untuk mengembangkan strategi
pengujian antigen baru. Pengikatan kitin direkapitulasi pada manik-manik kitin
menggunakan Cts1 rekombinan murni. Manik-manik kitin dicampur dengan Cts1
rekombinan, yang mengkonfirmasi pengikatan protein rekombinan ke kitin.
Protein fusi β-glucuronidase (Gus)-Cts1 digunakan untuk
mengukur hasil. Protein fusi Gus-Jps1, yang diharapkan tidak mengikat kitin,
berfungsi sebagai kontrol negatif. Manik-manik kitin dilapisi dengan protein
fusi Gus-Cts1 atau Gus-Jps1. Hanya protein fusi Gus-Cts1 yang terikat pada
butiran kitin, menguatkan kemampuan mengikat protein fusi N-terminal Cts1.
Mengukur intensitas sinyal mengungkapkan bahwa 44% protein
Cts1 rekombinan dan 68% protein fusi Gus-Cts1 ditangkap pada manik.
Fungsionalitas protein fusi setelah imobilisasi (pada manik-manik) dinilai.
Secara khusus, aktivitas Gus terdeteksi pada manik-manik yang diinkubasi dengan
ekstrak sel yang mengandung Gus-Cts1, menyiratkan retensi aktivitas fungsional
(enzimatik) meskipun imobilisasi pada manik-manik.
Akhirnya, uji imunosorben sandwich dilakukan pada pelat
ELISA dan manik-manik kitin untuk mengevaluasi kemampuan protein fusi nanobodi
VHHEE-Cts1 dan VHHE-Cts1. Sy68/15-Jps1 adalah kontrol di kedua tes, mengingat
bahwa itu harus menunjukkan aktivitas di ELISA tetapi tidak pada manik-manik
kitin. Protein fusi yang dimurnikan dilapisi pada pelat ELISA, diinkubasi
dengan RBD rekombinan yang diencerkan secara serial, dan dideteksi oleh
antibodi anti-RBD dan konjugat horseradish peroxidase (HRP) serumpun.
Sementara ketiga protein fusi nanobody dapat menangkap RBD
dalam pelat ELISA, hanya Sy68/15-Jps1 dan VHHEE-Cts1 yang menunjukkan aktivitas
volumetrik untuk pengenceran serial RBD. VHHEE-Cts1 menunjukkan peristiwa
pengikatan terkuat pada konsentrasi RBD terendah. Manik-manik kitin secara
terpisah diinkubasi dengan tiga protein fusi nanobody dan dicampur dengan RBD.
Baik VHHEE-Cts1 dan VHHE-Cts1 mempertahankan aktivitas pengikatan, sedangkan
Sy68/15-Jps1 tidak memiliki aktivitas pada manik kitin. Seperti temuan
sebelumnya, VHHEE-Cts1 menunjukkan aktivitas dua kali lipat lebih kuat daripada
VHHE-Cts1.
Kemampuan menangkap RBD dari sistem deteksi berbasis kitin
ini selanjutnya ditandai dengan menentukan aktivitas pengikatan volumetrik
menggunakan protein fusi nanobody yang paling kuat (VHHEE-Cts1). Manik-manik
kitin dimuat dengan VHHEE-Cts1 dan diinkubasi dengan RBD rekombinan yang diencerkan
secara serial. Aktivitas tersebut dideteksi dengan sandwich antibodi komersial.
Para peneliti mengamati reaksi kolorimetri dalam dua menit, dengan intensitas
sebanding dengan konsentrasi RBD.
Kesimpulan
Singkatnya, penelitian ini mencapai sekresi nanobodi mono
dan bivalen yang dimediasi Cts1 terhadap SARS-CoV-2. Ini memberikan bukti
prinsip untuk tes antigen SARS-CoV-2 berdasarkan kitin, yang difasilitasi oleh
mekanisme sekresi Cts1 yang tidak konvensional di U. maydis. Para penulis
memverifikasi penerapan protein fusi nanobody-Cts1 dalam deteksi dan
netralisasi virus in vivo. Ini menegaskan bahwa nanobody dapat mengikat virus
menular, selain lonjakan RBD. Para penulis yakin strategi ini dapat diubah menjadi
metode lab-on-a-chip untuk pengujian antigen SARS-CoV-2.
*Pemberitahuan Penting
bioRxiv menerbitkan laporan ilmiah awal yang tidak ditinjau
sejawat dan, oleh karena itu, tidak boleh dianggap sebagai konklusif, memandu
praktik klinis/perilaku terkait kesehatan, atau diperlakukan sebagai informasi
yang sudah mapan.
Journal reference:
Philipp, M. et al. (2022) "Efficient SARS-CoV-2
detection utilizing chitin-immobilized nanobodies synthesized inUstilago
maydis". bioRxiv. doi: 10.1101/2022.11.11.516239. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.11.11.516239v1
No comments