Para ilmuwan mengeksplorasi isolasi sarbecovirus kelelawar di Jepang

Read Also

Dalam penelitian terbaru yang dipublikasikan di Emerging Infectious Diseases, para peneliti melakukan percobaan isolasi sarbecovirus kelelawar menggunakan kelelawar Rhinolophus cornutus dari beberapa daerah di Jepang yang secara filogenetik terletak di kelompok virus yang sama terkait dengan severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2).

Highly pathogenic human beta-coronaviruses (β-CoVs) seperti severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV), SARS-CoV-2, dan Middle East respiratory syndrome CoV (MERS-CoV) telah dianggap berasal dari kelelawar. Oleh karena itu, pengawasan kelelawar β-CoV sangat penting untuk meningkatkan pemahaman dan untuk menilai potensi limpahan β-CoV pada manusia. Sarbecovirus yang diidentifikasi di negara-negara Asia seperti Cina telah dilaporkan beragam secara genetik; namun, variasi genetik dan distribusi sarbecovirus kelelawar di Jepang belum dikarakterisasi dengan baik dan memerlukan penyelidikan lebih lanjut.

Para penulis penelitian ini sebelumnya menunjukkan bahwa pseudotipe virus berbasis VSV (vesicular stomatitis virus) yang terdiri dari protein S (spike) dari sarbecovirus Rc-o319 dari R. cornutus hanya menginfeksi Rc-ACE2 (angiotensin-converting enzyme 2)-expressing sel, tetapi bukan sel pengekspresi ACE2 (hACE2) manusia atau sel pengekspres Rhinolophus ACE2 lainnya.

Tentang penelitian

Dalam penelitian ini, para peneliti melaporkan identifikasi, isolasi, dan karakterisasi biologis dan genetik sarbecovirus yang berasal dari kelelawar di berbagai lokasi di Jepang.

Sampel tinja diperoleh dari spesies kelelawar R. ferrumequinum dan R. cornutus di prefektur Chiba, Shizuoka, dan Niigata. Real-time RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction) dilakukan, dan tim membuat sel RcACE2-expressing Vero (Vero-RcACE2) berdasarkan sel Vero/transmembrane protease serine 2 (TMPRSS2).

Analisis Next-generation sequencing (NGS) dilakukan untuk menentukan whole-genome sequence dari semua isolat virus, dan sekuens tersebut disimpan dalam GenBank. Selain itu, analisis kesamaan plot dilakukan untuk sekuens genom lengkap dengan memanfaatkan setiap isolat sebagai kueri. Phylogenetic tree dibangun dari sarbecovirus kelelawar di Jepang berdasarkan whole-genome sequences dengan analisis kemungkinan maksimal dan replikasi bootstrap.

S RBM (receptor-binding motif) isolat kelelawar dari Jepang disejajarkan dengan sarbecovirus lainnya. Untuk menilai kinetika pertumbuhan isolat sarbecovirus dari kelelawar di Jepang, isolat kelelawar R. cornutus Rc-os20, Rc-o319, Rc-mk2, dan Rc-kw8 atau SARS-CoV-2 (strain B.1.1.7) diinokulasi menjadi sel Vero-RcACE2 [RcACE2, Vero/TMPRSS2 (WT)], Vero-hACE2 (hACE2), atau Vero-ACE2KO (ACE2KO) dan titer virus ditentukan menggunakan uji plak.

Hasil

Isolat menunjukkan pertumbuhan yang efisien dalam sel yang mengekspresikan Rhinolophus cornutus ACE2 tetapi tidak tumbuh dengan baik dalam sel yang mengekspresikan hACE2, menunjukkan bahwa isolat kelelawar memiliki kisaran inang yang sempit. Analisis RT-PCR memungkinkan deteksi urutan gen amplop (E) sarbecovirus yang berhasil dalam satu atau dua sampel Rhinolophus cornutus di setiap prefektur. Sarbecovirus kelelawar berhasil diisolasi dengan memanfaatkan kultur sel Vero-RcACE2, dengan efek sitopatik yang sangat besar dan pembentukan syncytium dari sampel kotoran kelelawar RT-PCR‒positif dari setiap prefektur.

Isolat kelelawar dari prefektur Shizuoka, Niigata, dan Chiba dirancang masing-masing sebagai Rc-kw8, Rc-os20, dan Rc-mk2. Selanjutnya, Rc-o319 diisolasi dengan memanfaatkan kultur sel Vero-RcACE2. Sebaliknya, semua sampel spesies Rhinolophus ferremuquinum negatif, menunjukkan bahwa sarbecovirus kelelawar didistribusikan di antara kelelawar Rhinolophus cornutus di Jepang. Urutan dari semua galur kelelawar yang diisolasi dari Jepang sangat homolog (berkisar antara 95% dan 97%). Namun, Rc-os20 dan Rc-mk2 tidak memiliki kode wilayah untuk ORF8 (open reading frame 8).

Tim mengamati kesamaan yang tinggi di antara isolat kelelawar di seluruh urutan genom, dengan pengecualian situs yang mengkode receptor-binding domain gen S (RBD) dan N-terminal domain (NTD). Namun, NTD Rc-kw8 dan Rc-o319 ditemukan dilestarikan. Tidak ada rekombinasi signifikan yang diamati di antara isolat kelelawar. Dalam analisis filogenetik, isolat diamati dalam satu kluster genetik yang terletak dalam klad genetik yang terdiri dari sarbecovirus yang terkait dengan SARS-CoV-2.

Temuan analisis Phylogenetic S RBD menunjukkan bahwa isolat dari Jepang diposisikan dalam clade genetik organisme virus yang memanfaatkan molekul ortolog ACE2 sebagai reseptor. Oleh karena itu, tim berasumsi bahwa strain baru yang diisolasi dari Jepang memanfaatkan RcACE2 sebagai reseptor. Isolat kelelawar direplikasi secara efisien hanya dalam sel Vero-RcACE2 tetapi tidak dalam sel Vero-ACE2KO, Vero/TMPRSS2, atau Vero-hACE2. Temuan menunjukkan bahwa isolat kelelawar bergantung pada RcACE2 untuk infektivitasnya.

Sebaliknya, SARS-CoV-2 menunjukkan replikasi yang efisien dalam sel Vero-RcACE2, Vero-hACE2, dan sel Vero/TMPRSS2 tetapi tidak bereplikasi dengan baik dalam kultur sel Vero-ACE2KO, menunjukkan bahwa infektivitasnya bergantung pada keberadaan beberapa reseptor ACE2, termasuk kelelawar Rhinolophus cornutus. Temuan menunjukkan bahwa kelelawar isolat Jepang hanya memanfaatkan bRcACE2 sebagai reseptor.

Mayoritas sekuens genom di antara galur-galur dari Jepang sangat terkonservasi, yang mungkin sejak Rhinolophus spp. spesies kelelawar bermigrasi ke jarak yang relatif pendek dan tidak sering melakukan kontak silang dengan kelompok kelelawar lainnya. Pengecualian adalah wilayah S yang mengkode RBD dan NTD, yang menunjukkan variasi genetik yang luas karena tekanan imunologis, menunjukkan bahwa kelelawar menyimpang dari strain leluhur belakangan ini.

Secara keseluruhan, temuan penelitian menunjukkan bahwa isolat kelelawar menggunakan batACE2 dalam bentuk reseptor tanpa replikasi dalam sel yang mengekspresikan hACE2, oleh karena itu, menjadi tipe karakteristik dan menunjukkan potensi infeksi manusia yang langka. Sarbecovirus dapat bermutasi dan menyebabkan infeksi pada manusia melalui spesies inang perantara pada ternak atau satwa liar. Oleh karena itu, studi epidemiologi sarbecovirus pada hewan liar, termasuk kelelawar, harus dilakukan dengan penilaian risiko jangka panjang terhadap potensi penularan zoonosis.

Journal reference:

Murakami S, Kitamura T, Matsugo H, Kamiki H, Oyabu K, Sekine W, et al. (2022). Isolation of bat sarbecoviruses, Japan. Emerging Infectious Diseases. doi: https://doi.org/10.3201/eid2812.220801 https://wwwnc.cdc.gov/eid/article/28/12/22-0801_article