Para ilmuwan mengeksplorasi isolasi sarbecovirus kelelawar di Jepang
Dalam penelitian terbaru yang dipublikasikan di Emerging Infectious Diseases, para peneliti melakukan percobaan isolasi sarbecovirus kelelawar menggunakan kelelawar Rhinolophus cornutus dari beberapa daerah di Jepang yang secara filogenetik terletak di kelompok virus yang sama terkait dengan severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2).
Highly pathogenic human beta-coronaviruses (β-CoVs) seperti
severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV), SARS-CoV-2, dan Middle
East respiratory syndrome CoV (MERS-CoV) telah dianggap berasal dari kelelawar.
Oleh karena itu, pengawasan kelelawar β-CoV sangat penting untuk meningkatkan
pemahaman dan untuk menilai potensi limpahan β-CoV pada manusia. Sarbecovirus
yang diidentifikasi di negara-negara Asia seperti Cina telah dilaporkan beragam
secara genetik; namun, variasi genetik dan distribusi sarbecovirus kelelawar di
Jepang belum dikarakterisasi dengan baik dan memerlukan penyelidikan lebih
lanjut.
Para penulis penelitian ini sebelumnya menunjukkan bahwa
pseudotipe virus berbasis VSV (vesicular stomatitis virus) yang terdiri dari
protein S (spike) dari sarbecovirus Rc-o319 dari R. cornutus hanya menginfeksi
Rc-ACE2 (angiotensin-converting enzyme 2)-expressing sel, tetapi bukan sel
pengekspresi ACE2 (hACE2) manusia atau sel pengekspres Rhinolophus ACE2
lainnya.
Tentang penelitian
Dalam penelitian ini, para peneliti melaporkan identifikasi,
isolasi, dan karakterisasi biologis dan genetik sarbecovirus yang berasal dari
kelelawar di berbagai lokasi di Jepang.
Sampel tinja diperoleh dari spesies kelelawar R.
ferrumequinum dan R. cornutus di prefektur Chiba, Shizuoka, dan Niigata.
Real-time RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction) dilakukan,
dan tim membuat sel RcACE2-expressing Vero (Vero-RcACE2) berdasarkan sel
Vero/transmembrane protease serine 2 (TMPRSS2).
Analisis Next-generation sequencing (NGS) dilakukan untuk
menentukan whole-genome sequence dari semua isolat virus, dan sekuens tersebut
disimpan dalam GenBank. Selain itu, analisis kesamaan plot dilakukan untuk
sekuens genom lengkap dengan memanfaatkan setiap isolat sebagai kueri. Phylogenetic
tree dibangun dari sarbecovirus kelelawar di Jepang berdasarkan whole-genome
sequences dengan analisis kemungkinan maksimal dan replikasi bootstrap.
S RBM (receptor-binding motif) isolat kelelawar dari Jepang
disejajarkan dengan sarbecovirus lainnya. Untuk menilai kinetika pertumbuhan
isolat sarbecovirus dari kelelawar di Jepang, isolat kelelawar R. cornutus
Rc-os20, Rc-o319, Rc-mk2, dan Rc-kw8 atau SARS-CoV-2 (strain B.1.1.7)
diinokulasi menjadi sel Vero-RcACE2 [RcACE2, Vero/TMPRSS2 (WT)], Vero-hACE2
(hACE2), atau Vero-ACE2KO (ACE2KO) dan titer virus ditentukan menggunakan uji
plak.
Hasil
Isolat menunjukkan pertumbuhan yang efisien dalam sel yang
mengekspresikan Rhinolophus cornutus ACE2 tetapi tidak tumbuh dengan baik dalam
sel yang mengekspresikan hACE2, menunjukkan bahwa isolat kelelawar memiliki
kisaran inang yang sempit. Analisis RT-PCR memungkinkan deteksi urutan gen
amplop (E) sarbecovirus yang berhasil dalam satu atau dua sampel Rhinolophus
cornutus di setiap prefektur. Sarbecovirus kelelawar berhasil diisolasi dengan
memanfaatkan kultur sel Vero-RcACE2, dengan efek sitopatik yang sangat besar
dan pembentukan syncytium dari sampel kotoran kelelawar RT-PCR‒positif dari
setiap prefektur.
Isolat kelelawar dari prefektur Shizuoka, Niigata, dan Chiba
dirancang masing-masing sebagai Rc-kw8, Rc-os20, dan Rc-mk2. Selanjutnya,
Rc-o319 diisolasi dengan memanfaatkan kultur sel Vero-RcACE2. Sebaliknya, semua
sampel spesies Rhinolophus ferremuquinum negatif, menunjukkan bahwa
sarbecovirus kelelawar didistribusikan di antara kelelawar Rhinolophus cornutus
di Jepang. Urutan dari semua galur kelelawar yang diisolasi dari Jepang sangat
homolog (berkisar antara 95% dan 97%). Namun, Rc-os20 dan Rc-mk2 tidak memiliki
kode wilayah untuk ORF8 (open reading frame 8).
Tim mengamati kesamaan yang tinggi di antara isolat
kelelawar di seluruh urutan genom, dengan pengecualian situs yang mengkode receptor-binding
domain gen S (RBD) dan N-terminal domain (NTD). Namun, NTD Rc-kw8 dan Rc-o319
ditemukan dilestarikan. Tidak ada rekombinasi signifikan yang diamati di antara
isolat kelelawar. Dalam analisis filogenetik, isolat diamati dalam satu kluster
genetik yang terletak dalam klad genetik yang terdiri dari sarbecovirus yang
terkait dengan SARS-CoV-2.
Temuan analisis Phylogenetic S RBD menunjukkan bahwa isolat
dari Jepang diposisikan dalam clade genetik organisme virus yang memanfaatkan
molekul ortolog ACE2 sebagai reseptor. Oleh karena itu, tim berasumsi bahwa
strain baru yang diisolasi dari Jepang memanfaatkan RcACE2 sebagai reseptor.
Isolat kelelawar direplikasi secara efisien hanya dalam sel Vero-RcACE2 tetapi
tidak dalam sel Vero-ACE2KO, Vero/TMPRSS2, atau Vero-hACE2. Temuan menunjukkan
bahwa isolat kelelawar bergantung pada RcACE2 untuk infektivitasnya.
Sebaliknya, SARS-CoV-2 menunjukkan replikasi yang efisien
dalam sel Vero-RcACE2, Vero-hACE2, dan sel Vero/TMPRSS2 tetapi tidak
bereplikasi dengan baik dalam kultur sel Vero-ACE2KO, menunjukkan bahwa
infektivitasnya bergantung pada keberadaan beberapa reseptor ACE2, termasuk
kelelawar Rhinolophus cornutus. Temuan menunjukkan bahwa kelelawar isolat
Jepang hanya memanfaatkan bRcACE2 sebagai reseptor.
Mayoritas sekuens genom di antara galur-galur dari Jepang
sangat terkonservasi, yang mungkin sejak Rhinolophus spp. spesies kelelawar
bermigrasi ke jarak yang relatif pendek dan tidak sering melakukan kontak
silang dengan kelompok kelelawar lainnya. Pengecualian adalah wilayah S yang
mengkode RBD dan NTD, yang menunjukkan variasi genetik yang luas karena tekanan
imunologis, menunjukkan bahwa kelelawar menyimpang dari strain leluhur
belakangan ini.
Secara keseluruhan, temuan penelitian menunjukkan bahwa
isolat kelelawar menggunakan batACE2 dalam bentuk reseptor tanpa replikasi
dalam sel yang mengekspresikan hACE2, oleh karena itu, menjadi tipe
karakteristik dan menunjukkan potensi infeksi manusia yang langka. Sarbecovirus
dapat bermutasi dan menyebabkan infeksi pada manusia melalui spesies inang
perantara pada ternak atau satwa liar. Oleh karena itu, studi epidemiologi
sarbecovirus pada hewan liar, termasuk kelelawar, harus dilakukan dengan
penilaian risiko jangka panjang terhadap potensi penularan zoonosis.
Journal reference:
Murakami S, Kitamura T, Matsugo H, Kamiki H, Oyabu K, Sekine
W, et al. (2022). Isolation of bat sarbecoviruses, Japan. Emerging Infectious
Diseases. doi: https://doi.org/10.3201/eid2812.220801
https://wwwnc.cdc.gov/eid/article/28/12/22-0801_article
No comments